Procedura barwienia metodą Grama w mikrobiologii

Barwienie metodą Grama jest różnicową metodą barwienia stosowaną do przypisywania bakteria do jednej z dwóch grup (gram-dodatnich i gram-ujemnych) na podstawie właściwości ich ściany komórkowe. Jest również znany jako barwienie metodą Grama lub metoda Grama. Procedura została nazwana na cześć osoby, która opracowała technikę, duńskiego bakteriologa Hansa Christiana Grama.

Procedura opiera się na reakcji między peptydoglikanem w ścianach komórkowych niektórych bakterii. Barwienie metodą Grama polega na barwieniu bakterii, utrwalaniu koloru zaprawą, odbarwianiu komórek i nakładaniu kontrastu.

1. Pierwotna bejca (krystaliczny fiolet) wiąże się z peptydoglikanem, zabarwiając komórki na fioletowo. Zarówno komórki Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne mają peptydoglikan w ścianach komórkowych, więc początkowo wszystkie bakterie zabarwiają się na fioletowo.
2. Jod Grama (jod i jodek potasu) stosuje się jako zaprawę lub utrwalacz. Komórki Gram-dodatnie tworzą krystaliczny kompleks fioletowo-jodowy.
instagram viewer
3. Alkohol lub do odbarwienia komórek stosuje się aceton. Bakterie Gram-ujemne mają znacznie mniej peptydoglikanu w ścianach komórkowych, więc ten etap zasadniczo czyni je bezbarwnymi, podczas gdy tylko część koloru jest usuwana z komórek Gram-dodatnich, które mają więcej peptydoglikanu (60-90% ściany komórkowej). Gruba ściana komórkowa komórek Gram-dodatnich jest odwadniana przez etap odbarwiania, powodując ich kurczenie się i zatrzymywanie wewnątrz kompleksu barwnik-jod.
4. Po etapie odbarwiania nakłada się kontrast (zwykle safraninę, ale czasem fuksynę) w celu zabarwienia bakterii na różowo. Zarówno bakterie Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne wychwytują różową plamę, ale nie jest ona widoczna nad ciemniejszym fioletem bakterii Gram-dodatnich. Jeśli procedura barwienia zostanie przeprowadzona prawidłowo, bakterie Gram-dodatnie będą fioletowe, a bakterie Gram-ujemne będą różowe.

Wyniki barwienia Grama są przeglądane za pomocą mikroskopii świetlnej. Ponieważ bakterie są zabarwione, nie tylko identyfikuje się ich grupę plam Gram, ale także ich kształt, rozmiar i wzór skupienia mogą być obserwowane. To sprawia, że ​​barwienie metodą Grama jest cennym narzędziem diagnostycznym dla kliniki medycznej lub laboratorium. Chociaż plama może zdecydowanie nie identyfikować bakterii, często wiedza o tym, czy są Gram-dodatnie, czy Gram-ujemne, wystarcza do przepisania skutecznego antybiotyku.

Niektóre bakterie mogą być gram-zmienne lub gram-nieokreślone. Jednak nawet ta informacja może być przydatna w zawężaniu tożsamości bakteryjnej. Technika ta jest najbardziej niezawodna, gdy kultury mają mniej niż 24 godziny. Chociaż można go stosować w hodowlach bulionowych, najlepiej najpierw je odwirować. Podstawowym ograniczeniem techniki jest to, że daje ona błędne wyniki, jeśli popełnione zostaną błędy w technice. Potrzebne są ćwiczenia i umiejętności, aby uzyskać wiarygodny wynik. Ponadto czynnik zakaźny może nie być bakteryjny. Patogeny eukariotyczne wybarwiają gram-ujemne. Jednak większość komórki eukariotyczne z wyjątkiem grzybów (w tym drożdży) nie przykleja się do szkiełka podczas procesu.

• Fiolet krystaliczny (pierwotna bejca)
• Jod Grama (mordant, w celu utrwalenia fioletu krystalicznego w ścianie komórkowej)
• Etanol lub aceton (odbarwiacz)
• Safranin (wtórne zabarwienie lub kontrast)
• Woda w tryskającej butelce lub butelce z zakraplaczem
• Szkiełka mikroskopowe
• Mikroskop złożony

1. Umieść małą kroplę próbki bakteryjnej na szkiełku. Zamocuj bakterie na szkiełku, przepuszczając je trzy razy przez płomień palnika Bunsena. Zastosowanie zbyt dużej ilości ciepła lub zbyt długo może stopić ściany komórkowe bakterii, zniekształcając ich kształt i prowadząc do niedokładnego wyniku. Jeśli zastosuje się zbyt mało ciepła, bakterie zmywają szkiełko podczas barwienia.
2. Użyj kroplomierza, aby nałożyć szkiełko podstawowe plamę (fiolet krystaliczny) i pozostawić na 1 minutę. Delikatnie opłucz szkiełko wodą nie dłużej niż 5 sekund, aby usunąć nadmiar plamy. Zbyt długie płukanie może usunąć zbyt dużo koloru, natomiast zbyt długie płukanie może pozwolić na pozostawienie zbyt dużej ilości plam na komórkach gramujemnych.
3. Za pomocą wkraplacza nałóż jod Grama na szkiełko, aby przymocować fiolet krystaliczny do ściany komórkowej. Pozostaw na 1 minutę.
4. Opłucz szkiełko alkoholem lub acetonem przez około 3 sekundy, a następnie delikatnie przepłucz je wodą. Komórki gram-ujemne stracą kolor, podczas gdy komórki gram-dodatnie pozostaną fioletowe lub niebieskie. Jeśli jednak odbarwiacz pozostanie zbyt długi, wszystkie komórki stracą kolor!
5. Nałóż drugą plamę, safraninę i odstaw na 1 minutę. Delikatnie spłucz wodą nie dłużej niż 5 sekund. Komórki Gram-ujemne powinny być zabarwione na czerwono lub różowo, podczas gdy komórki Gram-dodatnie nadal będą miały kolor purpurowy lub niebieski.
6. Wyświetl slajd za pomocą mikroskopu złożonego. Aby rozróżnić kształt i układ komórki, konieczne może być powiększenie od 500x do 1000x.

Nie wszystkie bakterie zidentyfikowane przez barwnik Grama są związane z chorobami, ale kilka ważnych przykładów obejmuje:

• Gram-dodatnie ziarniaki (okrągłe):Staphylococcus aureus
• Gram-ujemne ziarniaki:Neisseria meningitidis
• Gram-dodatnie pałeczki (pręty): Bacillus anthracis
• Pałeczki Gram-ujemne:Escherichia coli