Amplifikacja DNA poprzez reakcję łańcuchową polimerazy

PCR oznacza reakcja łańcuchowa polimerazy, technika biologii molekularnej do amplifikacji segmentów DNA poprzez generowanie wielu kopii przy użyciu enzymów polimerazy DNA w kontrolowanych warunkach. Tylko milion kopii segmentu DNA lub genu można sklonować w miliony kopii, co umożliwia wykrywanie za pomocą barwników i innych technik wizualizacji.

Opracowany w 1983 r. Proces PCR umożliwił wykonanie sekwencjonowanie DNA i określają kolejność nukleotydów w poszczególnych genach. Metoda wykorzystuje cykliczne cykle termiczne lub powtarzane ogrzewanie i chłodzenie reakcji do topienia i replikacji DNA. W trakcie PCR „nowy” DNA jest wykorzystywany jako matryca do replikacji i następuje reakcja łańcuchowa, wykładniczo wzmacniająca matrycę DNA.

Techniki PCR są stosowane w wielu obszarach biotechnologii, w tym inżynieria białek, klonowanie, kryminalistyka (pobieranie odcisków palców DNA), badanie ojcostwa, diagnoza chorób dziedzicznych i / lub zakaźnych oraz analiza próbek środowiskowych.

Szczególnie w kryminalistyce PCR jest szczególnie przydatna, ponieważ wzmacnia nawet najmniejszą ilość dowodów DNA. PCR można również wykorzystać do analizy DNA, który ma tysiące lat, a techniki te zostały wykorzystane do identyfikacji wszystkiego, od 800-letniego mamuta po mumie z całego świata.

Ten etap jest konieczny tylko w przypadku polimerazy DNA, które wymagają reakcji PCR na gorąco. Reakcję ogrzewa się do temperatury między 94 a 96 ° C i utrzymuje przez 1-9 minut.

Jeśli procedura nie wymaga inicjalizacji, pierwszym krokiem jest denaturacja. Reakcję ogrzewa się do 94-98 ° C przez 20-30 sekund. Wiązania wodorowe matrycy DNA są zakłócane i powstają jednoniciowe cząsteczki DNA.

Temperatura reakcji jest niższa do między 50 a 65 ° C i jest utrzymywana przez 20-40 sekund. Startery łączą się z matrycą jednoniciowego DNA. Temperatura jest niezwykle ważna na tym etapie. Jeśli jest za gorąco, podkład może się nie związać. Jeśli jest za zimno, podkład może związać się niedoskonale. Dobre wiązanie powstaje, gdy sekwencja startera ściśle pasuje do sekwencji matrycy.

Temperatura podczas tego etapu zmienia się w zależności od rodzaju polimerazy. Polimeraza DNA syntetyzuje zupełnie nową nić DNA.

Ten etap przeprowadza się w 70-74 ° C przez 5-15 minut po ostatnim cyklu PCR.

Ten krok jest opcjonalny. Utrzymuje się temperaturę 4-15 ° C i przerywa reakcję.

Podczas każdego cyklu produkt (konkretny fragment DNA, który jest replikowany) jest podwajany.

Gdy polimeraza DNA traci aktywność i zużywa odczynniki, reakcja zwalnia.

Nie gromadzi się więcej produktów.