Metody oczyszczania białek w biotechnologii

Ważnym elementem badań biotechnologicznych jest zastosowanie technik inżynierii białek do projektowania lub modyfikacji białek. Te techniki oczyszczania białka optymalizują właściwości białka dla określonych zastosowań przemysłowych.

Techniki te wymagają od naukowców izolacji i oczyszczenia interesujących białek, aby można było badać ich konformacje i specyficzność substratową. Konieczne są również badania nad reakcjami z innymi ligandami (białkiem, które przyłączają się do białka receptorowego) i specyficznymi aktywnościami enzymatycznymi.

Wymagany stopień czystości białka zależy od zamierzonego końcowego zastosowania białka. W niektórych zastosowaniach wystarczy surowy ekstrakt. Inne zastosowania, takie jak żywność i farmaceutyki, wymagają wysokiego poziomu czystości. Kilka technik dla oczyszczanie białka są używane do osiągnięcia wymaganego poziomu czystości.

Każdy etap oczyszczania białka zwykle powoduje pewien stopień utraty produktu. Dlatego idealna strategia oczyszczania białka to taka, w której najwyższy poziom oczyszczania osiąga się w jak najmniejszej liczbie etapów.

Wybór etapów do zastosowania zależy od wielkości, ładunku, rozpuszczalności i innych właściwości białka docelowego. Następujące techniki są najbardziej odpowiednie do oczyszczania pojedynczego białka cytozolowego.

Oczyszczanie cytozolowych kompleksów białkowych jest bardziej skomplikowane i zwykle wymaga zastosowania różnych metod.

Pierwszym etapem oczyszczania białek wewnątrzkomórkowych (wewnątrz komórki) jest przygotowanie surowego ekstraktu. Ekstrakt będzie zawierał złożoną mieszaninę wszystkich białek z cytoplazmy komórkowej oraz kilka dodatkowych makrocząsteczek, kofaktorów i składników odżywczych.

Ten surowy ekstrakt może być wykorzystywany do niektórych zastosowań w biotechnologii. Jeśli jednak problemem jest czystość, należy postępować zgodnie z kolejnymi etapami oczyszczania. Ekstrakty z białka surowego wytwarza się przez usunięcie resztek komórkowych powstałych w wyniku lizy komórek, co osiąga się za pomocą chemikaliów, enzymy, sonikacja lub prasa francuska.

Zanieczyszczenia usuwa się przez wirowanie, a supernatant (ciecz powyżej stałej pozostałości) odzyskuje się. Surowe preparaty białek pozakomórkowych (poza komórką) można uzyskać po prostu usuwając komórki przez wirowanie.

Na pewno biotechnologia W przypadku zastosowań istnieje zapotrzebowanie na enzymy termostabilne - enzymy, które mogą tolerować wysokie temperatury bez denaturacji, zachowując przy tym wysoką aktywność właściwą.

Organizmy wytwarzające białka odporne na ciepło są czasami nazywane ekstremofilami. Łatwym podejściem do oczyszczania białka odpornego na ciepło jest denaturacja innych białek w mieszaninie o ogrzewanie, a następnie ochłodzenie roztworu (umożliwiając w ten sposób termostabilnemu enzymowi zreformowanie lub ponowne rozpuszczenie, jeśli niezbędny). Zdenaturowane białka można następnie usunąć przez wirowanie.

Nowoczesny Biotechnologia protokoły często wykorzystują wiele dostępnych w handlu zestawów lub metod, które zapewniają gotowe rozwiązania standardowych procedur. Oczyszczanie białka jest często wykonywane przy użyciu filtrów i przygotowanych kolumn do filtracji żelowej.

Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do dializy, dodaj odpowiednią objętość odpowiedniego roztworu i poczekaj na określony czas podczas zbierania eluenta (rozpuszczalnik przepuszczony przez kolumnę) w świeżym teście rura.

Metody chromatograficzne można stosować przy użyciu kolumn stacjonarnych lub zautomatyzowanego sprzętu HPLC. Rozdzielanie metodą HPLC można przeprowadzić metodami odwróconej fazy, wymiany jonowej lub wykluczania wielkości, a próbki wykrywa się za pomocą matrycy diodowej lub technologii laserowej.

W przeszłości powszechnym drugim etapem oczyszczania białka z surowego ekstraktu było wytrącanie w roztworze o wysokiej wytrzymałości osmotycznej (tj. Roztwory soli). Wytrącanie białka odbywa się zwykle przy użyciu siarczanu amonu jako soli. Kwasy nukleinowe w surowym ekstrakcie można usunąć przez wytrącanie agregatów utworzonych z siarczanu streptomycyny lub siarczanu protaminy.

Wytrącanie soli zwykle nie prowadzi do wysoko oczyszczonego białka, ale może pomóc w wyeliminowaniu niektórych niepożądanych białek w mieszaninie i poprzez skoncentrowanie próbki. Sole w roztworze są następnie usuwane przez dializę przez porowate rurki celulozowe, filtrację lub chromatografię żelową.

Różne białka będą się wytrącać w różnych stężeniach siarczanu amonu. Zasadniczo białka o wyższej masie cząsteczkowej wytrącają się w niższych stężeniach siarczanu amonu.

Chromatografia w układzie faz odwróconych (RPC) oddziela białka na podstawie ich względnych hydrofobowości (wykluczenie niepolarnych cząsteczek z wody). Ta technika jest wysoce selektywna, ale wymaga użycia rozpuszczalników organicznych.

Niektóre białka są trwale denaturowane przez rozpuszczalniki i tracą funkcjonalność podczas RPC. Dlatego ta metoda nie jest zalecana do wszystkich zastosowań, szczególnie jeśli konieczne jest zachowanie docelowego białka.

Chromatografia jonowymienna odnosi się do rozdziału białek na podstawie ładunku. Kolumny można przygotować do wymiany anionowej lub kationowej. Kolumny anionowymienne zawierają fazę stacjonarną z ładunkiem dodatnim, który przyciąga ujemnie naładowane białka.

Kolumny wymiany kationowej to odwrócone, ujemnie naładowane kulki, które przyciągają dodatnio naładowane białka. Elucja (ekstrakcja jednego materiału z drugiego) docelowego białka (białek) odbywa się poprzez zmianę pH kolumna, co powoduje zmianę lub neutralizację naładowanych grup funkcyjnych każdej z nich białko.

Chromatografia wykluczania wielkości (znana również jako filtracja żelowa) oddziela większe białka od mniejszych te, ponieważ większe cząsteczki przemieszczają się szybciej przez usieciowany polimer w chromatografii kolumna. Duże białka nie mieszczą się w porach polimeru, podczas gdy mniejsze białka - i dłużej jeżdżą przez kolumnę chromatograficzną, w mniej bezpośredni sposób.

Eluat (wynik elucji) zbiera się w szeregu probówek oddzielających białka na podstawie czasu elucji. Filtracja żelowa jest użytecznym narzędziem do zatężania próbki białka, ponieważ białko docelowe jest zbierane w mniejszej objętości elucyjnej niż początkowo dodawane do kolumny. Podobne techniki filtracji można zastosować podczas produkcji białka na dużą skalę ze względu na ich opłacalność.

Chromatografia powinowactwa jest bardzo przydatną techniką do „polerowania” lub zakończenia procesu oczyszczania białka. Kulki w kolumnie chromatograficznej są usieciowane z ligandami, które wiążą się specyficznie z docelowym białkiem.

Białko jest następnie usuwane z kolumny przez płukanie roztworem zawierającym wolne ligandy. Ta metoda zapewnia najczystsze wyniki i najwyższą aktywność właściwą w porównaniu z innymi technikami.

SDS-PAGE (dodecylosiarczan sodu stosowany z elektroforezą w żelu poliakryloamidowym) wiąże się z białkami, dając im duży ładunek ujemny netto. Ponieważ ładunki wszystkich białek są dość równe, ta metoda dzieli je prawie całkowicie na podstawie wielkości.

SDS-PAGE jest często używany do testowania czystości białka po każdym kroku w serii. Ponieważ niechciane białka są stopniowo usuwane z mieszaniny, liczba pasm wizualizowanych na żelu SDS-PAGE jest zmniejszana, dopóki nie będzie tylko jednego pasma reprezentującego pożądane białko.

Immunoblotting to technika wizualizacji białek stosowana w połączeniu z chromatografią powinowactwa. Przeciwciała dla określonego białka stosuje się jako ligandy na kolumnie do chromatografii powinowactwa.

Docelowe białko jest zatrzymywane na kolumnie, a następnie usuwane przez płukanie kolumny roztworem soli lub innymi środkami. Przeciwciała połączone ze znacznikami radioaktywnymi lub barwnikowymi pomagają w wykrywaniu docelowego białka po jego oddzieleniu od reszty mieszaniny.