Techniki sekwencjonowania DNA

Pole biotechnologia jest ciągłą zmianą. Szybki wzrost i rozwój najnowocześniejszych badań zależą od innowacji i kreatywności naukowcy i ich zdolność dostrzegania potencjału w podstawowej technice molekularnej i zastosowania go do nowych procesy Nadejście reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) otworzył wiele drzwi w badaniach genetycznych, w tym za pomocą metody Analiza DNA i identyfikacja różnych genów na podstawie ich sekwencji DNA. Sekwencjonowanie DNA zależy również od naszej zdolności do używania elektroforeza żelowa do oddzielania nici DNA, które różnią się rozmiarem zaledwie o jedną parę zasad.

Pod koniec lat 70. XX wieku opracowano dwie techniki sekwencjonowania DNA dla dłuższych cząsteczek DNA: metodę Sangera (lub dideoksy) i metodę Maxama-Gilberta (cięcie chemiczne). Metoda Maxama-Gilberta oparta jest na cięciu specyficznym dla nukleotydów chemikaliami i najlepiej nadaje się do sekwencjonowania oligonukleotydów (krótkich polimerów nukleotydowych, zwykle o długości mniejszej niż 50 par zasad). Metoda Sanger jest częściej stosowana, ponieważ udowodniono, że jest technicznie łatwiejsza do zastosowania, a także nadejście PCR i automatyzacja tej techniki, można łatwo zastosować do długich nici DNA, w tym niektórych całych geny. Technika ta opiera się na zakończeniu łańcucha przez dideoksynukleotydy podczas reakcji wydłużania PCR.

W metodzie Sangera analizowana nić DNA jest używana jako matryca, a polimeraza DNA jest stosowana w reakcji PCR do generowania nici komplementarnych przy użyciu starterów. Przygotowuje się cztery różne mieszaniny reakcyjne PCR, każda zawierająca pewien procent analogów trifosforanu dideoksynukleozydu (ddNTP) do jednego z czterech nukleotydów (ATP, CTP, GTP lub TTP).

Synteza nowej nici DNA trwa do momentu włączenia jednego z tych analogów, w którym to momencie nić jest przedwcześnie skracana. Każda reakcja PCR zakończy się zawieraniem mieszaniny różnych długości nici DNA, wszystkie zakończone nukleotydem oznaczonym dideoksy dla tej reakcji. Żel elektroforeza jest następnie stosowany do rozdzielenia nici czterech reakcji na czterech osobnych ścieżkach i określenia sekwencji oryginalnej matrycy na podstawie tego, jakie długości nici kończą się jakim nukleotydem.

W zautomatyzowanej reakcji Sangera stosuje się startery, które są oznaczone czterema kolorowymi fluorescencyjnymi znacznikami. Reakcje PCR, w obecności różnych dideoksynukleotydów, przeprowadza się jak opisano powyżej. Jednak następnie cztery mieszaniny reakcyjne są następnie łączone i nakładane na pojedynczą ścieżkę żelu. Kolor każdego fragmentu jest wykrywany za pomocą wiązki laserowej, a informacje są gromadzone przez komputer który generuje chromatogramy pokazujące piki dla każdego koloru, z którego może pochodzić matrycowa sekwencja DNA ustalona.

Zazwyczaj metoda automatycznego sekwencjonowania jest dokładna tylko w przypadku sekwencji o maksymalnej długości około 700–800 par zasad. Możliwe jest jednak uzyskanie pełnych sekwencji większych genów i faktycznie całych genomów, stosując metody etapowe, takie jak Primer Walking i sekwencjonowanie Shotgun.

W Primer Walking sekcję wykonalną większego genu sekwencjonuje się metodą Sangera. Nowe startery są generowane z wiarygodnego segmentu sekwencji i używane do kontynuowania sekwencjonowania części genu, która była poza zakresem pierwotnych reakcji.

Sekwencjonowanie strzelby polega na losowym cięciu interesującego segmentu DNA na bardziej odpowiedni (zarządzalne) wielkości fragmentów, sekwencjonowanie każdego fragmentu i układanie elementów na podstawie nakładania się sekwencje. Technikę tę uprościło zastosowanie oprogramowania komputerowego do układania nakładających się elementów.