Wszystko o enzymach restrykcyjnych

Endonukleazy restrykcyjne są klasą enzym które tną cząsteczki DNA. Każdy enzym rozpoznaje unikalne sekwencje nukleotydów w nici DNA - zwykle o długości około czterech do sześciu par zasad. Sekwencje są palindromiczne, ponieważ komplementarna nić DNA ma tę samą sekwencję w odwrotnym kierunku. Innymi słowy, obie nici DNA są cięte w tym samym miejscu.

Enzymy restrykcyjne występują w wielu różnych szczepach bakterii, których biologiczną rolą jest udział w obronie komórek. Enzymy te ograniczają obcy (wirusowy) DNA, który dostaje się do komórek poprzez ich zniszczenie. Komórki gospodarze mają system modyfikacji restrykcyjnej, który metyluje własne DNA w miejscach specyficznych dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych, chroniąc je w ten sposób przed rozszczepieniem. Ponad 800 znane enzymy odkryto, że rozpoznają ponad 100 różnych sekwencji nukleotydowych.

Istnieje pięć różnych rodzajów enzymów restrykcyjnych. Typ I tnie DNA w losowych lokalizacjach aż do 1000 lub więcej par zasad od miejsca rozpoznania. Cięcie typu III w przybliżeniu w 25 parach zasad od miejsca. Oba te typy wymagają ATP i mogą być dużymi enzymami z wieloma podjednostkami. Enzymy typu II, które są głównie stosowane w biotechnologii, tną DNA w obrębie uznanej sekwencji bez potrzeby ATP i są mniejsze i prostsze.

Enzymy restrykcyjne typu II są nazywane zgodnie z gatunkami bakteryjnymi, z których są izolowane. Na przykład enzym EcoRI wyizolowano z E. coli. Większość społeczeństwa zna E. wybuchy coli w żywności.

Enzymy restrykcyjne typu II mogą generować dwa różne rodzaje cięć w zależności od tego, czy przecinają oba nici w centrum sekwencji rozpoznawania lub każda nić bliżej jednego końca rozpoznawania sekwencja.

Poprzednie cięcie spowoduje „tępe końce” bez zwisów nukleotydów. Ta ostatnia generuje „lepkie” lub „spójne” końce, ponieważ każdy powstały fragment DNA ma zwis, który uzupełnia inne fragmenty. Oba są przydatne w genetyce molekularnej do wytwarzania rekombinowany DNA i białka. Ta forma DNA wyróżnia się, ponieważ jest wytwarzana przez ligację (wiązanie ze sobą) dwóch lub więcej różnych nici, które pierwotnie nie były ze sobą połączone.

Enzymy typu IV rozpoznają metylowany DNA, a enzymy typu V wykorzystują RNA do cięcia sekwencji na atakujących organizmach, które nie są palindromiczne.

Enzymy restrykcyjne są stosowane w biotechnologii do cięcia DNA na mniejsze nici w celu zbadania różnic długości fragmentów między osobnikami. Jest to określane jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Są również używane do klonowania genów.

Techniki RFLP zostały wykorzystane do ustalenia, że ​​osobniki lub grupy osobników mają wyraźne różnice w sekwencjach genowych i wzorcach cięcia restrykcyjnego w niektórych obszarach genomu. Podstawą jest znajomość tych unikalnych obszarów Odcisk palca DNA. Każda z tych metod zależy od zastosowania elektroforeza w żelu agarozowym do oddzielania fragmentów DNA. Bufor TBE, który składa się z zasady Tris, kwasu borowego i EDTA, jest powszechnie stosowany do żelu agarozowego elektroforeza do badania produktów DNA.

Klonowanie często wymaga wstawienia genu do plazmidu, który jest rodzajem kawałka DNA. Enzymy restrykcyjne mogą pomóc w tym procesie ze względu na jednoniciowy zwis, który opuszczają podczas wykonywania cięć. Ligaza DNA, oddzielny enzym, może łączyć ze sobą dwie cząsteczki DNA o pasujących końcach.

Tak więc, stosując enzymy restrykcyjne z enzymami ligazy DNA, fragmenty DNA z różnych źródeł można wykorzystać do stworzenia pojedynczej cząsteczki DNA.